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龙之谷手游什么职业好:生物色譜用于中藥活性成分篩選

龙之谷手游战士转什么职业好 www.ouuvm.icu 來源:龙之谷手游战士转什么职业好位置:醫學論文時間:2018-08-20 15:1912

  摘要:生物色譜是基于受體藥理學、細胞生物學、液相色譜技術等原理,以生物活性材料為固定相配基的新型色譜技術,其特點在于能夠反映待測物的生理學及藥效學作用。該色譜技術用于中藥活性成分篩選具有高通量、特異性較強、分離篩選相結合等優勢,并為研究藥物與受體相互作用、蛋白質的分離提純及中藥質量控制等提供了新的方法。本文介紹了固定化脂質體色譜、細胞膜色譜、分子生物色譜等在中藥活性成分篩選領域中的應用。

生物色譜

  關鍵詞:生物色譜;固定化脂質體色譜;細胞膜色譜;分子生物色譜

  生物色譜(biochromatography)是將受體、載體蛋白、細胞膜等生物活性材料與載體結合作為固定相,利用生物活性物質間特異性結合的原理,結合液相色譜技術特點的新型色譜技術。傳統色譜技術對待測物的篩選分離是基于理化特性,雖然分離效能較高,但無法給出待測成分中與生物活性相關的信息。而生物色譜的固定相配基是具有生物活性的物質,因此待測物通過疏水力、范德華力、靜電作用等與固定相配基特異性結合,篩選分離出活性物質且測得的表達參數在一定程度上能夠反映待測物的生理學與藥效學意義[1]。

  與成分明確的化學藥物相比,中藥構成更為復雜。單味中藥材中含有大量的未知成分,復方中藥所含組分則更多,還存在組合藥效[2]。因此,從中藥材中篩選活性成分并明確其作用機制是一項重大挑戰。生物色譜技術能夠消除無活性成分對分析結果的干擾,縮小篩選范圍,同時與高效液相色譜、質譜等聯用還能對有效成分進行結構鑒定,為中藥篩選工作提供了簡便有效的方法。根據固定相種類的不同,本文介紹幾種較為常用的生物色譜技術。

  1固定化脂質體色譜用于中藥活性篩選

  固定化脂質體色譜法(immobilizedliposomechromatography,ILC)是將脂質體結合到硅膠載體表面制成固定相,利用液相色譜學技術研究流動相中待測物與脂質體相互作用的新型色譜法。脂質體固定化的方法主要有:凍融法、凍干再水化、反向蒸發、疏水吸附、滲析吸附等[3]。Liu等研發出了利用抗生物素蛋白-生物素親和單泡脂質體作為固定相[4],用氯甲酸酯活化孔徑較大的凝膠作為載體的脂質體色譜柱,這種色譜柱具有更好的穩定性,且對待測物干擾較小。

  脂質體是由磷脂制成的微球,具有與生物膜類似的磷脂雙分子層結構,活性成分在ILC上的色譜保留可以模擬其與生物膜的相互作用,反映活性成分在細胞膜上的穿透能力,研究表明,藥物在ILC色譜柱上測得的膜分配系數(logK)與在Caco-2模型上測定的膜滲透系數(logPc)有較好的相關性(r=0.913)[5]。因此,ILC可作為研究藥物跨膜吸收、口服藥物生物利用度以及蛋白質分離純化等方面的模型[6—8]。

  1.1一維脂質體色譜

  藥物活性成分在ILC上的分離機制在于與磷脂雙分子層間的相互作用,保留時間越長,說明與膜的作用力越強,該活性成分則更易透過細胞膜[9]。韓歡利用ILC對決明子及天麻中的活性成分進行了篩選分析[10],結果顯示,決明子乙醇提取物中至少含有7種活性成分,天麻乙醇提取液中至少含有3種活性成分。通過與對照品比對可知,決明子提取液中3種活性成分為蘆薈大黃素、大黃素及大黃酚;天麻提取液中1種活性成分為天麻素。決明子中的蘆薈大黃素、大黃酚及大黃素保留時間較長,推測透膜吸收能力強;天麻中的天麻素保留時間僅1.92min,推測透膜吸收能力較弱。

  Zhang等利用ILC研究甘草、黃芩和槐花中的活性成分,以及柱溫、流動相pH值的變化對3味中藥活性成分的影響[11]。結果,甘草甲醇提取液中約有10種組分在ILC上有保留行為,黃芩在ILC上也有較多特征峰,但槐花甲醇提取物在ILC上峰保留較弱。體液的pH值為7.4,細胞內液pH值為7.0,小腸上皮細胞pH值為5.4,因此通過改變流動相的pH值進一步研究3味中藥活性成分潛在作用部位。經試驗得出,3味中藥可能在小腸更易被吸收。試驗結果同時顯示,隨著柱溫升高,活性成分保留時間減小,這種現象也提示了如果患者發熱,藥物中的有效成分在人體內吸收會下降??杉?,ILC可用于中藥活性成分篩選,并初步判斷活性成分的吸收部位。

  1.2二維脂質體色譜

  Wang等以脂質體色譜柱為第一維色譜柱[12],硅膠整體柱(整體柱是由單體、引發劑、致孔劑等混合物在色譜柱內通過原位熱引發或光引發聚合而成的一個棒狀整體)為第二維色譜柱,建立了全二維高效液相色譜,用于研究北五味子中的活性成分。經檢測,北五味子中含有40種以上的活性成分,通過紫外圖譜及電噴霧電離質譜(ESI-MS)鑒定,14種組分結構均得到確證。該試驗中還采用主成分分析(PCA)及分層聚類分析(HCA)的統計方法,可以對不同產地的五味子進行質量控制??杉?,全二維液相色譜串聯質譜的方法可用于中藥活性物質篩選及道地藥材鑒別。

  劉琪等利用ILC與HPLC組成的二維生物膜色譜研究海綿細胞膜提取物中抑制血管緊張素轉化酶(ACE酶)的活性成分[13]。將磷脂酰膽堿類化合物與海綿細胞膜提取物進行分析,磷脂酰膽堿類標準品能在二維生物膜色譜上有效分離,但提取物在二維譜圖上未檢測到磷脂類化合物色譜峰,且在制備提取物時已除去蛋白質,由此推測海綿細胞膜中對ACE酶有抑制活性的成分為糖類化合物或其他小分子成分。

  1.3優勢與不足

  固定化脂質體色譜具有以下優勢:脂質體與細胞膜結構相似,能較好地模擬待測物與生物膜間的相互作用;與其他色譜聯用構成二維生物色譜提高了分辨能力與峰容量,縮短了分析時間[14]。但也存在如下問題:ILC分離能力目前仍不如HPLC;ILC上無載體蛋白,僅能篩選出被動吸收的藥物,經主動吸收途徑吸收的藥物在色譜柱上無保留[15]。

  2細胞膜色譜在中藥篩選中的應用

  細胞膜色譜(cellmembranechromatography,CMC)是將生物細胞膜或整個細胞固定在特定載體上作為固定相,結合了液相色譜技術、受體藥理學等理論,用于研究藥物與生物膜之間的親和性,以及篩選目標化合物的新型色譜技術。利用載體表面活性基團與生物膜之間的不可逆吸附作用以及細胞膜的融合作用制備細胞膜色譜柱。

  現代藥理學研究表明,藥物起效的關鍵在于與細胞膜上的受體、通道或酶相結合[16]。因此,藥物的細胞膜通透性對其生物活性非常重要。中藥待測物通過與細胞膜色譜柱上的自然細胞或受體高表達細胞相互作用,能夠達到活性物質篩選以及明確中藥有效成分作用的受體類型的目的。

  2.1自然細胞為固定相配基

  不同種類的細胞具有不同的作用靶點,因此中藥活性成分的藥理效應不同,選擇作為固定相配基的細胞也不盡相同。例如,選擇牙周膜細胞作為固定相配基篩選治療牙周炎的中藥活性成分[17];選擇心肌細胞篩選治療心血管疾病的活性成分[18];選取腎小球系膜細胞篩選治療腎病的活性成分等[19]。

  5-羥色胺(5-HT)受體與偏頭痛的發生密切相關,廣泛存在于紋狀體內,因此以紋狀體細胞膜為固定相配基可用于篩選治療偏頭痛的中藥活性成分。杜暉等制備了大鼠紋狀體細胞膜色譜用于研究川芎-白芷藥對中的治療偏頭痛的活性成分[20]。將所得細胞膜色譜圖與對照品比對,結果表明川芎-白芷藥對的活性成分為歐前胡素,并通過大鼠偏頭痛模型驗證了其藥理作用。該試驗還采用區帶流出法結合競爭方程分析活性成分與5-HT受體的親和作用,僅需模型藥物摩爾濃度和樣品容量因子即可測得藥物與受體親和作用的平衡解離常數,但也存在色譜重現性較差等問題。

  血管平滑肌(VSM)細胞上含有鉀離子通道,鉀離子通道的開放/關閉與血管收縮舒張密切相關,因此可采用VSM細胞作為固定相配基篩選具有擴張血管作用的中藥活性成分。王艷微利用大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞膜色譜法與離線LC/MS聯用[21],研究辛夷和吳茱萸提取物中擴張血管的活性組分。通過辛夷和吳茱萸提取物在VSM/CMC上的特異性保留以及LC/MS鑒定,可知辛夷中的擴張血管有效成分為辛夷脂素,吳茱萸中的活性成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿,并結合大鼠離體血管環試驗進一步探索活性組分的作用機制。細胞膜色譜結合動物模型構成活性成分篩選系統,能夠有效測定活性成分的藥理作用,并且通過與其他色譜聯用進行活性成分結構鑒定,對發現中藥中的有效成分具有重要價值。

  2.2受體高表達細胞為固定相配基

  自然細胞膜上的蛋白質種類較多,待測物可能與多種受體相互作用,因此使用自然細胞膜作為固定相進行試驗易受非特異性結合因素的干擾。利用現代分子生物學手段,研究者構建了受體高表達的CMC模型。王新等將β1腎上腺素受體(β1-AR)細胞膜色譜與UPLC/MS聯用[22],研究夏天無中與β1-AR作用的活性成分及其對該受體的抑制作用。夏天無提取液在CMC上有明顯保留行為,經UPLC/MS鑒定該保留組分為藥根堿。結合細胞試驗進一步研究了藥根堿對β1-AR的抑制作用,結果表明藥根堿可以降低細胞中環磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)水平,對β1-AR有拮抗作用。

  陳嘯飛等建立HepG2肝癌/CMC-TOF/MS全二維色譜系統[23],研究苦參和黃柏提取液中作用于高表達HepG2肝癌細胞膜上表皮生長因子受體(EGFR)的有效成分?;瓢丶翱嗖翁崛∫涸諫咨轄雜斜A糶形?,經鑒定,黃柏中的有效成分為小檗堿和四氫巴馬汀,苦參中含有苦參堿和氧化苦參堿。通過競爭置換模型證明4種活性成分與吉非替尼(EGFR拮抗劑)具有相同的作用位點,但具體作用位點尚不了解。該試驗使用了整體柱縮短了分離分析時間,并且使用飛行時間質譜(TOF/MS),可以在沒有對照品的條件下獲得較為準確的鑒別結果,為中藥有效成分的高通量篩選提供了新手段。

  2.3優勢與不足

  CMC無需分離提取步驟,藥物可直接在CMC模型上篩選活性成分,操作簡便快速[24];可用于預測中藥有效成分作用的受體,且測定的結果與傳統方法(如放射性配體結合試驗)結果具有顯著相關性[25—27];高表達細胞作為CMC的固定相能夠增加特定受體的表達量,對受體類型具有可控性。但也存在以下缺點:流動相的選擇不僅要考慮被測物的理化性質,還要考慮固定相上細胞膜的耐受性,因此CMC適用的藥物種類有限;CMC的洗脫液中無機鹽濃度較高,無法直接與質譜聯用,需要以HPLC為媒介,因此實驗操作步驟較復雜。

  3分子生物色譜

  分子生物色譜(molecularbiochromatography,MBC)是將受體、血漿運輸蛋白、酶、DNA等具有生理功能的生物大分子與載體結合作為固定相,利用分子特異性識別原理,研究生物分子相互作用的新型色譜技術。生物大分子通過吸附蛋白法、含間隔臂鍵和蛋白法以及不含間隔臂鍵和蛋白法等固定在載體上[28]。

  3.1血清白蛋白分子生物色譜用于中藥篩選

  藥物進入血液后能與血清蛋白、α1-酸性糖蛋白等發生可逆性結合,然而只有游離型藥物才能與活性位點結合引發藥效[29]。因此,研究能與血漿蛋白相互作用的活性成分對了解藥物在體內的藥動學行為具有重要意義。潘再法等采用牛血清白蛋白(BSA)分子生物色譜-氣相色譜(GC)-質譜(MS)聯用的方法測定當歸中的活性成分[30]。當歸甲醇提取液經分子生物色譜初篩后,保留組分使用GC-MS分離鑒定,共測得藁本內酯等8種活性成分。

  Wang等利用人血清白蛋白(HSA)生物色譜篩選中藥鐵棒錘中的有效成分[31]。鐵棒錘的總生物堿提取物經HSA色譜柱分離共有2個較強保留峰,保留成分經HPLC/MS分離鑒定,共分離出4種潛在活性成分。因此,血清白蛋白生物色譜可用于中藥活性成分的篩選,但HSA價格要高于BSA,故實驗多采用BSA。

  3.2脂筏色譜

  3.2.1單靶點抗腫瘤活性成分篩選

  脂筏是細胞膜磷脂雙分子層中含有特殊脂質和蛋白質的區域,與細胞內信號轉導、物質轉運等功能有關。將從腫瘤細胞中提取的脂筏用于腫瘤治療成為新的研究熱點[32]。脂筏色譜是以脂筏作為固定相配基,結合高效液相色譜、受體藥理學與分子生物學等原理,利用藥物與脂筏中特異受體間的親和力篩選分離所需組分的新方法。Tong等從腦膠質瘤細胞U251細胞中提取脂筏[33],其中含有酪氨酸蛋白激酶受體(TrkA),以此作為固定相配基建立TrkA脂筏色譜,用于研究中藥五倍子中的抗腫瘤活性成分。五倍子不同極性溶劑的萃取物經TrkA脂筏色譜分離后,僅五倍子乙醚萃取物在色譜上有保留行為,保留組分經NMR檢測鑒定為沒食子酸和沒食子酸乙酯。進一步通過四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)證明經脂筏色譜篩選出的保留組分具有較好的腫瘤細胞抑制效果。

  3.2.2多靶點抗腫瘤活性成分篩選

  目前中藥抗腫瘤活性成分的篩選多為單靶點篩選模式,然而藥物活性成分大多通過多靶點多途徑發揮治療作用,因此多組分多靶點活性成分篩選模式的開發將成為主流。屈睿從乳腺癌MCF-7細胞株中提取了富含表皮生長因子(EGFR)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)及凋亡相關蛋白因子(Fas)的脂筏建立了多靶點脂筏色譜[34],研究北葶藶子中抗腫瘤的活性成分。北葶藶子的不同極性溶劑萃取液經脂筏色譜篩選后,僅北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位具有保留行為。該活性部位經MTT法考察后,表明北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位對4種腫瘤細胞株均具有抑制作用。該脂筏色譜實現了對中藥活性成分多靶點高效在線篩選,改變了中藥單靶點篩選的現狀。

  3.3優勢與不足

  以血清白蛋白為固定相的分子生物色譜可以測定待測物與血清白蛋白間的相互作用,為血漿結合率提供參考數據[35]。脂筏色譜具有較強特異性,無需專門培養受體高表達細胞,且壽命較細胞膜生物色譜要長的優點[36]。但也存在如下問題:分離能力較差;色譜柱專一性強,不能用于多類物質的分離;易產生不可逆吸附,分離過程慢等。

  4結語

  通過上述介紹,生物色譜用于中藥活性成分篩選的總體實驗思路可總結如下:首先依據實驗目的選擇特定生物活性物質作為固定相配基;進樣后,根據待測物在生物膜色譜上是否具有膜透性,或在分子生物色譜上是否對特定受體具有選擇性,篩選出所需活性物質;最后與HPLC、NMR、MS等聯用對篩選出的活性成分進行結構鑒定,從而實現中藥活性物質的篩選、分離、鑒定一體化。雖然生物色譜技術具有無需對樣品分離純化、能夠反映藥理學特性、特異性較強等優點,但也存在制備成本高、色譜柱使用壽命較短、難以實現商品化、無法模擬體內復雜的代謝環境致使活性成分篩選不全面等問題[37]。隨著后續研究的深入開展,生物色譜在中藥活性成分篩選領域將擁有更廣闊的應用空間。

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